Rhizosphere、Rhizoplane到底谁才是根际，根际土该如何取？
本文转载自“微生物生态”，己获授权。
师弟（男）：师兄师兄，根际土该怎么取？
本葱：查文献！
师妹（女）：师兄，根际土该怎么取？
本葱：你这个问题问得好，来来来，师兄跟你讲……
根际（Rhizosphere）是指受植物根系活动的影响，在物理、化学和生物性质上不同于土体的那部分微域土区。根际的范围很小，一般指离根轴表面数毫米之内。
说到根际（Rhizosphere）不得不提Bulk、Rhizoplane、Endosphere，尤其是Rhizosphere与Bulk、Rhizosphere与Rhizoplane经常傻傻分不清。
在文章“Structure,variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice”中给出的解释是比较经典的，如下图：
Bulk（编号B）：大田土（微生物）、非根际（微生物）。
Rhizosphere（编号S）：根际（微生物），来自根际土。
Rhizoplane（编号P）：根表（微生物），紧密附着根表面、部分来自根皮。
Endosphere（编号E）：内生（微生物）。
文中给出的方法：
Rhizosphere（编号S）：文中将根表约1mm土壤视为根际土，根放入PBS中充分搅动，洗下、收集浊液，不离心，同一天内取部分浊液用作提DNA。本文为手工搅动，（也有放入摇床中搅动的）。本文是在同一天完成DNA提取所以没有离心，若要保存，可高速离心后收集土壤进行保存。
Rhizoplane（编号P）：将上述根再次放入PBS中+超声震荡1次（30s 50-60Hz）。由于此部分微生物较少，提取后作者对DNA进行了浓缩。
Endosphere（编号E）：额外两次超声震荡，玻珠击打均质后，用于提取DNA。
*注：一般地，内生微生物DNA提取方法：”表面消毒+效果检测“+研磨→DNA提取。 表面消毒：次氯酸、乙醇等，根据植物组织而异，就如叶片、根、种子的消毒力度是不一样的。目的，去除根表微生物。 效果检测不可忽略。检测表面消毒效果，是否完全去除根表的微生物，这是保证测序结果是内生菌的前提。方法：只要能证明根表无微生物即可。如，取消毒过程中最后一次无菌水进行培养，看是否有微生物生长；或是用PCR定量的方法等。 |
师妹（女）：谢谢师兄^^
本葱：等下，先别走~多了解些才能掌握根际土取样的“度”
（师弟在远远地偷听）
针对最受关注的根际土（Rhizosphere），有大量的文章介绍样品采集方法：
Comparative 16S rDNA and 16S rRNA sequence analysis indicates that Actinobacteria might be a dominant part of the metabolically active bacteria in heavy metalcontaminated bulk and rhizosphere soil 2003，Environment Microbiology，被引：179（被引为文章被引，并不代表此方法被引，下同） 遏蓝菜（Thlaspi caerulescens） 抖落Bulk Soil，将仍粘附（adhering）在根表面的土壤视为根际土（rhizosphere）。将其放入50ml无菌0.9% NaCl溶液适度搅动（moderate agitation）5min，然后8000g离心10min收集土壤。(该文引Marilley et al., 1998)。 |
Bulk and Rhizosphere Soil Bacterial Communities Studied by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis: Plant-Dependent Enrichment and Seasonal Shifts Revealed 2001，Applied And Environment Microbiology，被引：922 草莓、油菜、土豆 剧烈震荡（shaken vigorously）去除松散的土，然后将其放入9mL无菌水中，SewardStomacher®400混合器最大转速处理1min，低速离心（2min，500g）取上清，将沉淀用相同方法洗两次，合并三次上清，高速离心（30min，10000g）沉淀微生物细胞。 *（本葱）注：此法随搅拌力度的不同，可能会得到不同数量的内生菌。 |
Bacterial diversity in rhizosphere soil from Antarctic vascular plants of Admiralty Bay, maritime Antarctica 2010，The ISME Journal，被引：152 维管植物：Deschampsia antarctica Desv(Poaceae) and Colobanthus quitensis (Kunth) BartI (Caryophyllaceae) 将5g根放入50ml 0.85%NaCl溶液中摇动1h，10min 9000g离心取沉淀。 |
Distinct Microbial Communities within the Endosphere and Rhizosphere of Populus deltoides Roots across Contrasting Soil Types 2011，Applied And Environment Microbiology，被引：154 杨树 无菌水洗5次，收集土壤。 |
Microbial 16S gene-based composition of a sorghum cropped rhizosphere soil under different fertilization managements 2015，Biology and fertility of soils，被引：5 高粱 轻轻抖动去除Bulk Soil，紧附在根上的土用无菌水冲洗。 |
……
此外，若是要求不严，有些研究也把根系抖落下来的土视为根际土，但或许称其为root-zone soil较为合适。
综上，研究目的及样品的差异可能导致方法上略有不同，大体思路是：
1去除（抖落）根周松散的土→2缓冲液震荡洗下根际土（紧密粘附）→3高速离心收集沉淀→4保存
第1步，应尽量保证完整的根组织，并去除多余的土。
第2步，为防止在震荡过程中对微生物和根组织细胞的破坏，此处建议使用缓冲液，如PBS或生理盐水，若震荡时间较短、强度较低或是其他特殊要求不能用缓冲液，也有用无菌水处理的。震荡时有手动的，也有用摇床等震荡的，时间和强度根据洗涤的难易程度和根组织而异。
第3步，如果无需保存且立即使用，建议不必离心，直接以浊液为样品；但若需保存，可高速离心后收集土壤沉淀。若沉淀较少，也可用提取水体DNA的方法，经0.22μm孔膜过滤收集土壤及微生物细胞。
第4步，低温保存-80℃。
参考前人的方法是为了站在“科学”的肩膀上，但不假思索的参考可能会站在错误的方向！
本葱没有讨厌师弟（男），只是更喜欢师妹（女）~
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